【中图分类】R733.1 【文献标识码】A 【文章编】1672-3783（2011）02-0229-02

作者简介：王志国(1973-),男，副工作人员，硕士，主要从事造血干细胞移植工作。

【摘要】外周血干细胞冻存是外周血干细胞移植成功的关键技术之一，探索一种安全简便的外周血干细胞冻存方法可以更加方便临床应用。应用终浓度为5 %二甲基亚砜(DMSO),3 %羟乙基淀粉(HES)和2%人血白蛋白(ALB)作为干细胞保护剂-80℃低温冰箱储存外周血干细胞，分析169份造血干细胞回输前后资料; 台盼兰检测细胞成活率，Mouse anti-Human CD34检测干祖细胞比例变化, 人造血干细胞甲基纤维素培养基MethoCult R GFH4534检测细胞活性。结果表明:根据复苏细胞时间的不同，不同冻存时间的造血干细胞在半年内复苏的活性变化差异不大，6个月时,冻存干细胞的细胞活性、MNC 回收率、GM-CFU和CD34 + 细胞回收率以分别为84、 62%、87、 87%、92、 92%、93.28%与冻存1个月相比无统计学差异(P>0.05) ,但在冻存1年时，造血干细胞的细胞活性及GM-CFU与冻存1个月相比有统计学差异( P

【关键词】外周血干细胞；冷冻保存；移植

外周血造血干细胞移植已经广泛应用于很多医学领域，在恶性血液DNA中的应用尤为广泛，其中造血干细胞的冷冻保存对于外周血干细胞移植中能否成功已经成为关键技术，并且探讨和证实这些方法的安全性和有效性可以为循证医学提供更有力的证据。我们应用终浓度为5 %二甲基亚砜(DMSO) 、3 %羟乙基淀粉(HES) 、2 %人体白蛋白(HSA)的外周血干细胞冻存剂冻存外周血干细胞，对169份标本进行分析，证实该方法在临床上的有效性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂:DMSO(100% ,Amresco)，羟乙基淀粉(6% ,德国费森尤斯卡比有限公司)，人血白蛋白(20% ,哈尔滨世享生物工程药业股份有限公司)，Mouse anti-Human CD34（BD公司，cat:550761）。

1.2 DNA例与外周血干细胞动员采集:169份外周血干细胞冻存标本，患者年龄7～63 岁,中位年龄25 岁。所有样本均为自体外周血干细胞。采用的化疗方案为CY+TBI,在白细胞降至低谷并开始回升时给予G-CSF动员 ,当WBC>10.0×109/L时开始采集。经采集后,获得外周血干细胞达到MNC>4.5×108/kg ,CD34+细胞>4×106/kg的标准再进行移植回输。

1.3 外周血造血干细胞的冻存:DMSO，羟乙基淀粉，人血白蛋白按比例与采集的干细胞液混合,使DMSO、羟乙基淀粉及人血白蛋白的终浓度分别为5%、3%和2% ,然后分装于冻存袋(50ml,美国百特公司) 中, 平放以便降温均匀,直接置于-80℃冰箱(国内海尔公司) 中保存。留少许样品送检:台盼蓝染色、MNC计数、CFU2-GM检测（人造血干细胞甲基纤维素培养基MethoCult R GF H4534）、CD34+ 细胞检测(BD公司FACSCantoTMII) 。

1.4 外周血造血干细胞的复苏:回输时将冻存袋从- 80 ℃冰箱中取出,尽快放置于39 ℃水浴箱中快速解冻,以防止冰晶的形成,解冻后的干细胞在短时间内回输到患者体内,同时留少许样品进行检测。

1.5 外周血造血干细胞检测:对采集的外周血干细胞和复苏后的外周血干细胞分别取样进行台盼蓝拒染率、MNC 计数、CFU-GM、CD34 + 细胞指标检测,计算回收率。

1.6 外周血干细胞在患者体内的重建:患者在回输外周血造血干细胞后恢复造血的指标为：外周血中白细胞>1000/ml; 血小板>20000/ml。患者细胞回输当天为零天，以此计算造血恢复时间。

1.7 统计学处理:检测结果以均数±标准差(x±s)表示, t 检验求出P 值进行分析。

2 结果

Figure 1 Rates of typeran blue resistance after peripheral blood stem cells recovery

2.2 外周血造血干细胞MNC计数检测:MNC计数结果显示, 外周血造血干细胞冻存时间的延长对MNC的回收率影响并不是很大,主要影响因素是受细胞死亡造成的，一年复苏细胞MNC的回收率是87.28% (表1)

2.3 外周血造血干细胞CFU-GM检测:CFU-GM培养结果显示, 在一年后复苏的外周血造血干细胞，其CFU-GM回收率降低明显，为65.21% ,与冻存后30天复苏的造血干细胞相比较有统计学差异（P

2.4 外周血造血干细胞CD34+检测:外周血造血干细胞CD34 +回收率检测显示, 一年内复苏的细胞CD34 +回收率下降不明显，30天复苏细胞的CD34 +回收率是9652%，与冻存后360天及400天相比较没有统计学差异（P>0.05），如表2所示。

Figure 2 Change of recovery rate of CFU-GM of peripheral blood stem cells* P

2.5 外周血干细胞在患者体内的重建：

在患者回输冻存3个月内的外周血干细胞后，造血能够达到外周血中白细胞>1000/ml; 血小板>20000/ml指标的时间为9-18天，中位时间为13天，所有患者回输都在3个月内完成，回输后均未出现DMSO中毒反应。

3 讨论

外周血干细胞的冻存对于细胞移植是一项关键技术,对移植是否成功起决定作用。1983年Stiff。PJ[1]等采用5% DMSO-6% HES细胞冻存剂在-80℃冰箱成功保存骨髓细胞，为造血干细胞在医学各领域的广泛应用提供了便捷，安全的方法。我国对干细胞- 80 ℃冻存研究也得到快速发展[2，3，4，5 ]，随着造血干细胞冻存技术的发展，目前公认的长时间保存方法是终浓度10%二甲基亚砜-196℃液氮保存。但是这一保存方法在临床应用中仍然有一定的局限性，高浓度的DMSO干细胞回输容易导致患者引起恶心、呕吐以及血压增高、心律失常等毒副作用,另外冻存干细胞时需要程序降温仪、液氮罐等一系列设备,而且需要液氮供给，给临床操作带来不便，而且成本相对过高。因此在临床需要一种较为简便的干细胞冻存方法。采用终浓度为5 %二甲基亚砜(DMSO),3%羟乙基淀粉(HES)和2%人血白蛋白(HSA)的干细胞保护剂-80℃冰箱冻存外周血干细胞已经在临床中应用, 我们应用此方法对不同时间点样本检测到的指标观察发现，在6个月内外周血干细胞的细胞活性,MNC、CFU-GM和CD34+细胞的回收效率与冻存1 个月相比较无明显差异(P>0.05) ；在360天时复苏冻存干细胞，其CFU-GM 出现明显下降（回收率为65.21%），与冻存1 月相比较有统计学意义(P

参考文献

[1] Stiff PJ ,Murgo AJ,Zaroulis CG,et al。 Unfractionated human marrow cell cryopreservation using dimethylsulfoxide and hydroxyethyl starch。Cryobiology,1983;20:17-24

[2] 黄友章,汪声恒,杨平地,等。人骨髓细胞长期低温保存的研究。 国内应用生理学杂志, 2001;17:359-378

[3] 杨平地,黄友章,沈建良,等。低温冻存对骨髓基质细胞生物学特性的影响。国内应用生理学杂志,2003;19:306-308

[4] 汪声恒,黄友章,向丹。 用低温冰箱冻存骨髓的实验研究。 医用冷冻术,1987;4:3-4

[5] 彭贤贵,陈幸华,张曦,等。 -80℃冻存外周血干细胞21 例分析。重庆医学，2003；32：340-341

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